原谷生物

免疫分析中异质性抗体干扰相关问题的探讨

来源: 时间:2017-12-20

 免疫分析在过去的30年中有了巨大的进步和提高,但由于动物抗血清是这些试验的基本成分,所以存在免疫球蛋白(包括异质性抗体、分析物自身抗体等)的干扰,造成假性的和可能导致误诊的结果,继而给患者造成不适当的进一步测试、不正确的诊断和治疗以及潜在的不利结果。因此,重视这些干扰的类型、分析原因、寻找对策,同时与临床医生合作用集体的智慧、能力和经验进行分析总结,排除干扰,合理地对试验结果进行解释,从而提高诊断水平是每个检验工作者义不容辞的职责。

1异质性抗体

1.1定义

异质性抗体是在人血清中存在的,能识别商品化试剂中应用的动物免疫球蛋白的抗体(如鼠或兔免疫球蛋白)。当免疫原物质,如蛋白或免疫球蛋白,从一个种属引入另一个种属时即 可产生异质性抗体。

1.2 人抗动物抗体

一般来说,人因诊断或治疗的目的用过其他动物制剂,就可能产生抗这种动物的抗体,即人抗动物抗体(human anti-animal antibodyHAAA)。主要包括人抗动物免疫球蛋白、人抗动物白蛋白和人抗昆虫糖蛋白等。如果患者使用过来自小鼠的药物或显像剂,就可以产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibodyHAMA),它是影响最大的。按这种形式产生的抗体,一般是特异性抗体并且具有高滴度。

1.2.1 HAAA产生原因

医源性途径:预防接种,实施非常规治疗,如注射抗网织红细胞增多剂会产生抗兔抗体。

非医源性途径:包括母婴传递、动物耕作和饲养宠物以及在患有腹腔疾病等情况下通过肠壁的食物抗原传递。

1.2.2抗体类型和特异性

人抗动物抗体有IgGIgAIgM IgE几种类型。人抗动物免疫球蛋白(immunoglobulinIg)的抗体可有抗独特型和抗同种型特异性,还可产生抗抗独特型抗体。通常同种型抗体比独特型抗体更常见。目前己报道了多种动物免疫球蛋白特异的人循环抗体,包括抗小鼠、抗兔、抗山羊、抗绵羊、抗牛、抗猪、抗大鼠、抗马、抗嵌合抗体以及混合特异性抗体。其中最常见的是HAMA。抗兔和山羊Ig的抗体也特别重要。这几种动物常作为免疫分析试剂中抗体的来源。由于不同种动物Ig分子间蛋白质序列有大量同源性。因此抗动物抗体可与多种动物Ig发生交叉反应。如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、 牛、豚鼠、兔、猫和狗等。

1.2.3 HAAA对免疫分析的干扰机制及进展

异质性抗体可以与免疫分析应用的动物抗体结合,并由此产生错误的结果。在双位点夹心免疫分析中,该抗体在无抗原的条件下,可以联接捕捉抗体和检测抗体,导致假阳性结果;在另一种情况下异质性抗体可能阻断捕获抗体或标记抗体降低其结合抗原的能力,从而使抗原和信号抗体不能固定在固相上,在洗涤过程中去除,使结合信号出现假阴性。另外,在固相竞争性免疫分析中,HAMA通过阻断捕获抗体的结合位点造成干扰。这可能为HAMA与捕获抗体或标记抗体的抗原结合区反应而阻止其与分析物反应之故。待测抗原和标记抗原与捕获抗体的高亲和力可把干扰降到最小。但若HAMA浓度高或样品用量大仍可出现干扰;用双抗体技术把结合与游离标记物分离,仍存在干扰问题。

还有一些因素在干扰中起非常重要的作用:(1)由于试剂抗体浓度总是固定的,而干扰抗体的滴度对每个患者都是不同的, 因此干扰抗体与试剂抗体相比,具有较宽范围的亲和力,如果进行样本稀释将会进一步改变试剂抗体和干扰抗体的比例,继而导致更加严重的后果;(2)捕捉抗体是单克隆的,信号抗体有单克隆的也有多克隆的,而干扰抗体通常为多克隆的。抗原对单克隆抗体结合的亲和力较单一,当免疫反应涉及多克隆抗体时会更加复杂多变;(3)自动化仪器的诞生,使实验周转时间(time around time, TAT)大幅缩短,当干扰抗体滴度较高时,这种全自动、短温育时间的非平衡试验会增加对干扰的敏感度,干扰强度 大于干扰的亲和力;(4)免疫试验的干扰强度取决于试验形式、 相关干扰抗体的亲和力及其滴度。有些干扰抗体,或是抗原或是试剂抗体,作为互相反应的实体未能确认,当成为抗原-抗体结合复合物后会改变免疫分析的动力学;(5)抗原可以有一个以上的表位,抗体也可有一个以上的对位,在平衡免疫分析中通常按优先结合原则,但正常的结合反应可以在抗原或抗体上有一个以上的结合位点,干扰抗体的存在会打破这种结合反应,造成不同的干扰结果。所有这些因素都提示抗体干扰保持着它是隐蔽的、可变的和不可预见的问题。

1.2.4 HAAA检测方法

HAAA测定对鉴定免疫分析技术中可能出现的假性高值或低值及在治疗上评估反复使用动物源性制剂可能的并发症具有重要意义。HAMA的检测方法包括免疫复合物直接测定法(高压液相色谱法)、免疫荧光测定、免疫荧光抑制试验、免疫放射法、酶联免疫吸附试验法、反向ELISA法 和斑点杂交法。这些方法非一般临床实验室所能应用。HAMA 测定的校准物包括狒狒抗鼠IgG、血清或来源于注射单克隆抗体的患者血浆。目前国外已有多种HAMA检测试剂盒,甚至床边检验试剂,但是由于分析技术特异性差异和缺乏标准化,使各方法间和实验室间缺乏可比性。

1.2.5 HAAA克服方法

(1) 封闭剂法:是目前比较常用的方法,此法通过加入未经免疫的同种动物血清或纯化的同源非特异性免疫球蛋白对样品作预处理来减少或消除HAAA干扰。一般采用产生单克隆抗体动物的血清或多克隆IgG或聚合IgG。阻断剂的阻断效力取决于HAAA的浓度、种类、分子亚型、特异性和效价。这些阻断剂通过与样品中人抗动物抗体结合而抑制其干扰免疫分析。 目前国外己有Ig阻断剂(IIR)和嗜异性阻断剂(HBR)等多种阻断剂商业供应。

(2) 改变试验系统:应用不同类型的单克隆抗体的试验系统,或者采用竞争法重新进行测定,均能解决干扰问题,但此法不完全可靠。

(3) 聚乙二醇(polyethylene glycolPEG)沉淀法或亲和层析法:PEG法采用PEG6000HAAA进行沉淀以达到清除 HAAA的目的。此外,蛋白A、阳离子交换或凝胶过滤层析法也 可以作为排除HAAA干扰的辅助手段。虽然非免疫血清或纯免疫球蛋白的加入及各种阻断剂的使用排除了大多数的 HAAA干扰,具有高滴度HAAA的血清仍然存在非特异性干扰。在有些情况下,HAAA虽然被清除,但阻断剂的使用却引 起质控样品的浓度漂移。

(4) 酸和热联合处理:在某些情况下对样品进行热和酸处理 可以达到阻断HAAA于扰的目的。例如在癌胚抗原(carcino- embryonic antigen, CEA)免疫分析中,将样品在酸性环境下加热 至70°C90°C能使HAAA干扰得到遏制。但此法在多数情况下不可取,因为在这种热和酸条件下大多数被分析物都会被破坏。

(5) 蛋白G:蛋白G能与所有4IgG亚类分子的Fc片 段结合。因此,可以将蛋白G固相于sepharose珠对待测血清进行免疫抽提来清除其中的所有IgGHAMA

(6) 应用改造的抗体:用人工组合的抗体,即将动物Fab与 人Fc组合,可消除对IgG类抗体试剂的Fc段有特异性反应性的抗动物抗体干扰;应用嵌合抗体作分析试剂可消除抗小鼠和其它动物抗体引起的干扰。另一办法是用鸡抗体作分析试剂,因为哺乳动物和鸡IgG无交叉反应性,故可消除人抗哺乳动物抗体对免疫分析的干扰。但此法制备困难而且价格昂贵,不适于临床实验室使用。

2 免疫分析中抗体干扰的预防

由于免疫分析的复杂多变,所以对其干扰的预防应从以下几方面努力:

1)从标本中清除或灭活干扰性免疫球蛋白,可通过将患者标本预先用PEG或滤过的方法共沉或分离聚合物,但应根据测试项目进行适当选择;

2)改造抗体,以减少与异质性抗体的反应。动物抗体的人源化和抗体改造(采用去除Fc片段的方法);

3)封闭剂的使用,采用产生单克隆动物的血清或多克隆IgG或聚合IgG,目前一些商品化试剂己包含封闭剂可有效去除干扰;

4)应用缓冲液添加剂可预防或降低干扰,天然的动物免疫球蛋白常有效。

另外,在常规实验室建立一个处理潜在干扰的质量系统也是很重要的。当然这会涉及员工的培训(包括实验室操作人员、 样本采集人员),发展和改良标准操作步骤,建立检测预警值,与临床医生的沟通机制,干扰发现后与厂商的沟通机制等。

3 抗体干扰的医学意义及人文思考

3.1医学意义

当患者的医疗决策与试验结果相关联,而没有在临床上确证的好方法时,试验干扰可造成明显的医学问题。尽管实验室专业人员没有可靠的方法检测干扰抗体的存在,但其临床意义是非常大的。由于分析方法特异性的不同和缺乏标准化使得不同方法间的比较也变得相对复杂。用肿瘤标志物检测肿瘤和对内分泌疾病的激素标志物是这个关键试验检测的最佳例证。如用于诊断绒毛膜上皮癌的人绒毛膜促性腺激素(hCG); 检测前列腺癌的前列腺特异抗原 (PSA); TSH对于甲状腺功能亢进及低下的诊疗;检测卵巢癌的糖链抗原CA-125; CEA;泌乳素;cTnl 等等都是著名的例子,下面举几个典型实例以引起大家的关注。

ColeKhanlian报告hCG是一项重要的试验,用于证实妊娠、确定妊娠性滋养叶细胞疾病和男性的睾丸胚胎性肿瘤。由于是一个强有力的肿瘤标志物,在非妊娠妇女和男性出现,即使没有症状也标志着恶性的疾病过程。作者报告了因其假阳性结果,使患者接受侵袭性方法的治疗,包括:刮宫、腹腔镜、化疗、子宫切除、输卵管卵巢切除和开胸术。给患者带来了极大的痛苦和经济损失,同时也使医患关系变得复杂。Birkland报道了美国西雅图一位22岁女性因异质性抗体干扰使hCG假阳性而经历化疗、子宫切除、肺部分切除,最终法院判给她1600万美元。 RotmenschCole报告了12例误诊为绒毛膜上皮癌而进行治疗的病例,均是由于在免疫分析中的异质性抗体搭桥干扰hCG检测所致,男性患者有假阳性hCG可被误诊为睾丸精原细胞瘤。

PSA是前列腺癌筛查和肿瘤复发的关键标志物,临床医生常根据PSA的测定值决定做进一步的侵袭性检查,如前列腺活检或昂贵的影像学检查。最近的报告表明,可能的过度治疗是由于假性PSA测定结果所致,而这些假性结果是由于异质性抗体搭桥的结果。一位49岁男性患者,由于其PSA未达到手术后的预期值而使用激素治疗和放射治疗。

CA-125是一种肿瘤标志物,用以监测卵巢癌的复发和对高危人群是否患卵巢癌的评估。用于CA-125试验的单克隆抗体也用于卵巢癌的治疗,注射这种抗体常使异质性抗体增加,并造成假阳性的实验结果,即使没有这种免疫治疗,有些患者手术后可产生内源性异质性抗体,并造成卵巢癌复发的假象, 用CA-125评估可能患卵巢癌的高危人群,往往导致多余的腹腔镜和腹腔细胞学的检查。

这些实例不但给我们深刻的教训,同时还给实验室和临床敲响了警钟,可见二者之间的交流和合作何等重要。

3.2人文思考

在医疗中,一定的误诊率是难免的,在我国临床医疗总误诊率为27.8%,比国际平均的临床医疗总误诊率25%2.8个百分点,其中恶性肿瘤误诊率为40%。抗体干扰造成的误诊也是原因之一,和其它原因导致的误诊一样,所有抗体干扰造成临床误诊的病例,最终都不同程度的造成患者遭受过度医疗(如各种相关的实验室检查、影像学检查、侵袭性检查及不必要的治疗)的危害。使患者物质和精神上都受到了折磨,给社会和家庭带来了沉重的负担,也使医患关系更加恶化。

尽管在本文中讨论了免疫分析中可能存在的干扰,但免疫分析仍是一个强有力的检测系统。没有能事先确定标本有免疫干扰的实用的方法。因此,实验室工作人员必须加强学习,不断吸收新的知识和获得新的技能,不断提高业务水平,提高综合素 质,同时依赖与临床医生的交流去确定可能由于试验干扰造成的可疑的试验结果。当实验室示警后,应进行各种相关检测排除干扰,稀释线性试验、加入回收率、异质性抗体封闭和用另一种技术再测定等简单的步骤,有助于对怀疑有试验干扰的病例进行评价。我们不相信现在计数测量可以完全消除抗体的干扰,我们等待着最终根治方法的来临。只有临床化学家、实验室检测人员、生产厂家和临床医生共同努力才能解决干扰问题、 提高诊断水平,从而更好地为患者服务。

在线咨询